活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

YIJI 活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

YIJI 活體細(xì)胞線粒體損傷/氧化熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過(guò)特異性染色劑分析線粒體膜心磷脂的變

化來(lái)定性或定量測(cè)定線粒體內(nèi)含質(zhì)量以及自由基、氧化物等對(duì)細(xì)胞線粒體的毒性與損傷作用的而經(jīng)典

的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、

代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

心磷脂（Cardiolipin）是線粒體膜上的主要成分之一。它對(duì)細(xì)胞氧化特別敏感。線粒體脂類分解，致使心磷

脂顯著減少，zui終造成線粒體的嚴(yán)重?fù)p害。Nonyl-Acrydine Orange（NAO）是一種可自由通過(guò)細(xì)胞膜的染

色劑，特異性地染色線粒體上的心磷脂，并發(fā)出熒光。一旦線粒體膜質(zhì)量減少或受到損害以及被氧化，其

熒光顯著減弱。

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 清理液（Reagent A）        毫升

YIJI 染色液（Reagent B）       微升

YIJI 稀釋液（Reagent C）        毫升

YIJI 保存液（Reagent D）        毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                     1份

保存方式

保存 YIJI 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照，其余的保存在 4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細(xì)胞脫離*細(xì)胞培養(yǎng)液（YJ12052）：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15 毫升錐形離心管：用于細(xì)胞操作的容器

1.5 毫升離心管：用于細(xì)胞染色的容器

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀細(xì)胞

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

比色皿：用于細(xì)胞熒光分析的容器

熒光顯微鏡：用于觀察熒光細(xì)胞

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

1

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 脫離或懸浮細(xì)胞分析

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時(shí)開(kāi)啟熒光顯微鏡或熒光光度儀。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 1 瓶 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞（約 1 X 106細(xì)胞）

2． 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液

3． 加入 xx 毫升 YIJI 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面

4． 小心抽去 YIJI 清理液（Reagent A）

5． 加入 xx 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶表面

6． 置入 37℃培養(yǎng)箱 1 分種

7． 震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

8． 加入 4 毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

9． 移入到 15 毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞可以從這一步驟開(kāi)始）

10．移取 10 微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

11．移出 1 X 106細(xì)胞到新的 15 毫升錐形離心管

12．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

13．小心抽去上清液

14．加入 xx 毫升含有 YIJI 染色液（Reagent B）和 YIJI 稀釋液（Reagent C）的 YIJI 染

色工作液，輕柔混勻

15．放進(jìn) 37℃恒溫水槽孵育 20 分鐘，避免光照

16．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

17．小心抽去上清液

18．加入預(yù)冷的 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群

19．放進(jìn)冰槽里

20．即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析（選擇下列其中一種）：

（A）波長(zhǎng) 580nm（紅光），觀察 50000 個(gè)細(xì)胞以上

波峰左移，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒

體損傷或氧化）

（B）波長(zhǎng) 488nm（綠光），觀察 50000 個(gè)細(xì)胞以上

波峰左移或降低，表明線粒體受到損害或被氧化，活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低

（線粒體損傷或氧化）

21．或使用熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1） 移出 50 微升在載玻片上

2） 即刻進(jìn)行載玻片壓片（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長(zhǎng) 580nm，散發(fā)波長(zhǎng) 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長(zhǎng) 495nm，散發(fā)波長(zhǎng) 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

22．或使用熒光分光光度儀

2

1） 移取 xx 微升染色后的細(xì)胞樣品到用戶自備的 1 毫升比色皿

2） 加入 xx 微升 YIJI 保存液（Reagent D）

3） 上下傾倒混勻

4） 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀測(cè)讀：濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 580nm，散發(fā)波長(zhǎng) 630nm或?yàn)V波器激發(fā)波長(zhǎng) 495nm，

散發(fā)波長(zhǎng) 519nm：活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對(duì)

熒光單位（RFU）降低

二、貼壁細(xì)胞分析（熒光酶標(biāo)儀法定量分析）

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）在室溫下融化，YIJI 稀

釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 毫升 YIJI 稀釋液（Reagent C）到新的

15 毫升錐形離心管，加入 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B），混勻后，在室溫下靜置，并標(biāo)記為

YIJI 染色工作液，放在暗室里。同時(shí)開(kāi)啟熒光顯微鏡或熒光酶標(biāo)儀。然后進(jìn)行下列操作。

1． 從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出待測(cè)的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板

2． 小心抽去每孔中的培養(yǎng)液

3． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個(gè)孔里

4． 小心抽去每孔中的 YIJI 清理液（Reagent A）（注意：確保培養(yǎng)孔中無(wú)任何液體殘留）

5． 小心加入 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液到 96 孔板中每一個(gè)孔里

6． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里，孵育 20 分鐘

7． 小心抽去每孔中的 YIJI 染色工作液（注意：確保培養(yǎng)孔中無(wú)任何液體殘留）

8． 小心加入 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A）到 96 孔板中每一個(gè)孔里

9． 放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測(cè)讀：濾波器激發(fā)波長(zhǎng) 580nm，散發(fā)波長(zhǎng) 630nm，閃爍次數(shù) 10，間隔時(shí)間 0.5 秒

或?yàn)V波器激發(fā)波長(zhǎng) 495nm，散發(fā)波長(zhǎng) 519nm，閃爍次數(shù) 10，間隔時(shí)間 0.5 秒：活性氧族含量高，脂類

物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）――相對(duì)熒光單位（RFU）降低

三、切片染色分析

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 YIJI 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，YIJI

稀釋液（Reagent C）放進(jìn) 37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出 xx 微升 YIJI 染色液（Reagent B）到新

的 1.5 毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 稀釋液（Reagent C），混勻后，將 YIJI 染色工作液置入

暗室里。同時(shí)開(kāi)啟熒光顯微鏡。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備 1 個(gè)待測(cè)的切片樣品

2． 小心加上 xx 微升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋切片表面

3． 小心移去切片上的 YIJI 清理液（Reagent A）

4． 小心加上 xx 微升含有 YIJI 染色液（Reagent B） YIJI 稀釋液和（Reagent C） YIJI的

染色工作液，覆蓋切片表面

5． 放進(jìn) 37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育 20 分鐘

6． 小心移去切片上的染色液

7． 小心加上 xx 微升新鮮的 YIJI 清理液（Reagent A）

8． 小心移去 YIJI 清理液（Reagent A）

9． 蓋上蓋玻片

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10．即刻在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：（選擇下列其中一種）

（A）激發(fā)波長(zhǎng) 580nm，散發(fā)波長(zhǎng) 630nm

紅光減弱，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

（B）激發(fā)波長(zhǎng) 495nm，散發(fā)波長(zhǎng) 519nm

綠光減弱或降低，表明活性氧族含量高，脂類物質(zhì)降解，線粒體質(zhì)重降低（線粒體損傷或氧化）

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 400 次（4 個(gè) 96 孔板）、200 次（200 個(gè)切片）或 20 次操作（1 毫升處理液）

2． 所有操作均須無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行

3． 操作時(shí)，須戴手套

4． 染色劑可以自由進(jìn)入細(xì)胞

5． 孵育時(shí)，必須避免光照

6． 建議細(xì)胞染色完成后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析

7． 紅光檢測(cè)具有特異性，而綠光檢測(cè)線粒體質(zhì)量變化

8． 細(xì)胞流式儀分析細(xì)胞檢測(cè)量不得少于 10000 個(gè)

9． 如果出現(xiàn)紅光或綠光增強(qiáng)或右移，可能出現(xiàn)染料與胞漿內(nèi)脂類物質(zhì)非特異性結(jié)合，因此根據(jù)不同細(xì)胞

類型，調(diào)整 YIJI 染色工作液的使用劑量（1：100 至 1：1000 容量比），避免過(guò)度染色，干擾檢

測(cè)

10．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰