線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V 活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V 活性光譜法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）
主要用途
YIJI 線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V（F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶）活性光譜法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用丙
酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定與 ATP 合成對(duì)應(yīng)的 ATP 水解產(chǎn)生 ADP 過(guò)程中，伴隨的
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法測(cè)定樣品中酶活性的
而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種純化線粒體樣品（動(dòng)
物、人體、酵母）以及細(xì)胞或組織裂解懸液樣品的 F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶的特異性活性檢測(cè)?？捎糜谛?br />肌、能量代謝、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，
操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
線粒體呼吸鏈復(fù)合物V，通常稱(chēng)為ATP合成酶（ATP synthase） F型ATP酶 type ATPase）、（F和F1F0 ATP酶（F1F0
ATPase），是線粒體氧化磷酸化的*反應(yīng)。其分子量為500KD，含有十六個(gè)亞單位，其中兩個(gè)：ATP酶6
和8為線粒體DNA編碼的。ATP酶主要有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：F0為質(zhì)子通道，由幾個(gè)膜蛋白構(gòu)成，包括a、b、c、d、
e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性結(jié)構(gòu)域，由水溶性的α3β
3γδε蛋白構(gòu)成。其zui特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。復(fù)合物V的主要功能在于產(chǎn)生大部分
細(xì)胞所需的能量ATP。ATP的合成需要線粒體內(nèi)膜電子傳遞到氧分子時(shí)，呼吸鏈蛋白所產(chǎn)生的質(zhì)子梯度變化。
質(zhì)子通過(guò)F0結(jié)構(gòu)域傳遞到基質(zhì)，激活F1催化活性結(jié)構(gòu)域，促使ATP合成。該酶異常會(huì)導(dǎo)致心肌和神經(jīng)系統(tǒng)
疾病?；贏TP，在寡霉素參與下，受到F1F0 ATP酶的水解，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）
和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide
adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），
產(chǎn)生的吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析F1F0 ATP酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI 緩沖液（Reagent A）
YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
YIJI 陰性液（Reagent C）
YIJI 底物液（Reagent D）
YIJI 專(zhuān)性液（Reagent E）
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
毫升
毫升
毫升
微升
微升
1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI 反應(yīng)液（Reagent B），避免光照，有效保證 6 月
用戶自備
比色皿：用于光譜分析的容器
1

分光光度儀：用于光譜分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）注
意避光。然后進(jìn)行下列操作。
一、 測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如純化線粒體樣品等），置于冰槽里（注意：檢測(cè)前溶解線粒體；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 4）
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 340nm，間隔 30 秒，讀數(shù) 11 次（共 5 分鐘），并置零
二、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘
5． 加入 xx 微升 YIJI 陰性液（Reagent C）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 1 分鐘或 5 分鐘
三、 樣品總活性測(cè)定
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘
5． 加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 4）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 1 分鐘或 5 分鐘
四、 樣品非特異活性測(cè)定
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，移取 100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白；樣品須溶解；參見(jiàn)注意事項(xiàng) 4）到 1.5
毫升離心管，加入 xx 微升 YIJI 專(zhuān)性液（Reagent E），混勻后，放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 15 分鐘。然
后置于冰槽里備用
1． 移取 xx 微升 YIJI 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2． 加入 xx 微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent B）
3． 加入 xx 微升 YIJI 底物液（Reagent D）
4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 3 分鐘
2

5． 加入 120 微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 1 分鐘或 5 分鐘
五、 計(jì)算樣品活性
1）樣品活性（總活性和非特異活性）
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)】÷【0xx（樣品容量；毫升）Xxx（毫
摩爾吸光系數(shù) X 1 或 5（反應(yīng)時(shí)間，分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾 NADH/分鐘
2）樣品特異活性
樣品總活性測(cè)定－樣品非特異活性測(cè)定＝樣品特異活性
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為 21 次操作（10 個(gè)樣本），包括 1 次背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次
4． 線粒體樣品檢測(cè)前，須溶解；建議超聲處理（20 秒 X 3 循環(huán)；50％功率）或凍存融解（－70℃至 37℃）
循環(huán) 3 次或使用 YIJI 線粒體溶解試劑盒－GMS10018
5． 建議線粒體懸液使用 0.25 M SUCROSE 和 2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸緩沖溶液
6． 建議使用線粒體裂解懸液，而不是細(xì)胞裂解懸液。如果使用細(xì)胞裂解懸液，*須澄清；第二須加 50
微克
7． 加入樣品后 3 秒內(nèi)即刻光譜測(cè)定
8． 反應(yīng) 1 分鐘后光譜測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可以持續(xù) 5 分鐘
9． 測(cè)定值由高到低變化，即 0 分鐘測(cè)定讀數(shù)高于 1 分鐘或 5 分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
10．光譜測(cè)定后，比色皿須清洗*
11．建議待測(cè)樣本線粒體蛋白濃度為 10 微克/100 微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣
本量；注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 YIJI 線粒體溶解試劑盒 GMS10018 為后續(xù)的線粒體蛋
白濃度測(cè)定的預(yù)處理試劑盒和 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 GMS30030.1）
12．樣品特異活性是指寡霉素敏感的 ATP 合成酶，去除其它干擾因素（例如復(fù)合物 I/II/III/IV 等）
13．線粒體呼吸鏈復(fù)合物 V 酶活性單位濃度定義：在 30℃溫度下，pH 7.5 條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化 1 微
摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
14．本公司提供系列線粒體及其酶類(lèi)技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確