YIJI組織樣品細(xì)胞色素C氧化酶活性測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

YIJI組織樣品細(xì)胞色素C氧化酶活性測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

YIJI組織樣品細(xì)胞色素C氧化酶活性測定試劑是一種旨在通過細(xì)胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中還原性細(xì)胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體、植物、昆蟲等）裂解懸液中細(xì)胞色素C氧化酶的活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的細(xì)胞線粒體上，主要通過氧化磷酸化為細(xì)胞提供能量?；诘孜镞€原型細(xì)胞色素C（reduced cytochrome c），受到細(xì)胞色素C氧化酶的催化，轉(zhuǎn)化為氧化型細(xì)胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度儀下，出現(xiàn)吸光值的變化（550nm 波長），由此定量測定細(xì)胞色素C氧化酶的活性。細(xì)胞色素C氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A）                                  毫升
YIJI裂解液（Reagent B）                                  毫升
YIJI緩沖液（Reagent C）                                  毫升
YIJI反應(yīng)液（Reagent D）                                  毫升
YIJI稀釋液（Reagent E）                                      毫升
YIJI穩(wěn)定液（Reagent F）                                      微升
產(chǎn)品說明書                                                   1份

保存方式

保存YIJI清理液（Reagent A）、YIJI緩沖液（Reagent C）和YIJI稀釋液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)液和樣品制備的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿：用于比色的容器
分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟
 
樣品準(zhǔn)備

手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定組織重量 
（選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
（選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要xx毫升）YIJI清理液（Reagent A）清洗1次
移入到一個(gè)液氮凍存管
即刻放進(jìn)液氮罐過ye
次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
加入預(yù)冷的xx微升YIJI裂解液（Reagent B） 
轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br />放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
測讀準(zhǔn)備

準(zhǔn)備好待測樣品，置于冰槽里融化 
設(shè)定好分光光度儀：溫度25℃，波長550nm，間隔10秒，測讀7次（共60秒），并置零或設(shè)置0秒和60秒各測讀1次
測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI反應(yīng)液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升離心管，加入xx微升YIJI穩(wěn)定液（Reagent F），輕柔混勻后，室溫下避光靜置至少15分鐘（可見顏色變化），置于冰槽里，標(biāo)記為YIJI反應(yīng)工作液（注意：參見注意事項(xiàng)4），放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。

背景對照測定

移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
加入xx微升YIJI稀釋液（Reagent E）
上下傾倒數(shù)次，混勻
室溫下孵育2分鐘
放進(jìn)分光光度儀，置零
取出比色皿，加入xx微升含有YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI穩(wěn)定液（Reagent F）的YIJI反應(yīng)工作液
上下傾倒數(shù)次，混勻
即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），
樣品測定

移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
加入100微升待測樣品（注意：建議總量50微克總蛋白，且樣品需澄清）
上下傾倒數(shù)次，混勻
室溫下孵育2分鐘
放進(jìn)分光光度儀，置零
取出比色皿，加入xx微升含有YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI穩(wěn)定液（Reagent F）的YIJI反應(yīng)工作液
即刻上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0秒讀數(shù)－60秒讀數(shù)），
計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

本產(chǎn)品為20次操作，包括背景對照
操作時(shí)，須戴手套
樣品制備中忌用DTT和巰基乙醇等處理
每增加1個(gè)樣品，增加YIJI反應(yīng)工作液為：YIJI反應(yīng)液（Reagent D）50微升＋YIJI穩(wěn)定液（Reagent F）1.5微升，以此類推。配制反應(yīng)工作液時(shí)，須根據(jù)樣本數(shù)量配制實(shí)際工作液容量。
系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
分光光度計(jì)波長嚴(yán)格設(shè)置在550nm，誤差10nm將不產(chǎn)生信號
加樣后3秒內(nèi)進(jìn)行比色測定
比色測定后，比色皿須清洗*
背景空對照0秒讀數(shù)通常0.2至0.8為理想狀態(tài)
背景空對照的正常讀數(shù)差值（0秒－60秒）通常為0.001至0.005（正負(fù)即可）
樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對照0秒讀數(shù)一致
樣本測定60秒讀數(shù)低于0秒讀數(shù)表明具有酶活性
酶活性單位濃度定義：在25℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的細(xì)胞色素C
建議待測樣本總蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，即60秒讀數(shù)不變或?yàn)榱?，則可以增加或降低樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
本公司提供系列細(xì)胞色素相關(guān)試劑產(chǎn)品

 
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感